| 摘要：采用柠檬酸钠还原法制备了3种不同粒径的胶体金纳米粒子，分别用于与蛋白质分子标记。同时以琼脂糖凝胶为支持介质，观察其在电场条件下的泳动行为特征，并进行对比研究。结果表明，在特定电场条件下，胶体金纳米粒子愈小，其泳动速度愈快，但呈现弥散状分布特征。当胶体金颗粒包敷蛋白分子后即可得到很好的分离，且随标记的蛋白质分子不同而存在很大程度的差异，其在琼脂糖凝胶中的泳动速度依次为BSA，SPA，rhCAHIgG-r球蛋白分子。该工作为研究特定生物结构分离、配体分子检测及微器件制作方面提供了新的思路。 关键词：胶体金；纳米粒子；电场；蛋白质；电泳 中图分类号：R318；TB383 文献标识码：A文章编号：1671-4776（2003）09-0035-04 1引 言
早期研究表明，许多生物胶体如蛋白质、核酸和多糖等常以颗粒的形式分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用，并可在电场中向阴极或阳极泳动，泳动的方向则取决于其所带电荷的符号，且它们均有特征的迁移率(electrophoretic mobility)，利用这种电泳特征作为对物质的分离和鉴定已广泛应用于生物科学研究领域[1，2]。胶体金(GC)作为憎水性胶体颗粒，周围包绕着大量吸附的离子所形成的静电分子层，带有负电荷，故亦可在电场中泳动。当胶体金溶液被置于一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力F抗衡。在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律
F=6πrυη 这里是在介质黏度为叩的溶液中，半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中这种抗衡并不完全符合斯托克斯定律。F还取决于介质中的其他因素，如凝胶的厚度、胶体颗粒的尺寸及支持介质的电内渗等[1]。有关胶体颗粒在特定电场中的泳动速度可用下列公式表示
v=Em=mJ／K 其中月为电位梯度，m为电泳迁移率，J为电流密度，K为粒子的导电性。
本文在制备不同粒径胶体金纳米粒子的基础上，将蛋白质分子包敷于颗粒表面，同时观察其在琼脂糖凝胶电泳中的泳动行为和分布特征，探索其在特定生物结构分离等方面的应用价值。 2 材料与方法 2．1 主要试剂
琼脂糖(Agarose)、氯金酸(HAuCl4)、对苯二酚和牛血清白蛋白(BSA)均为Sigma公司产品；葡萄球菌A蛋白(SPA)、山羊抗人IgG-r球蛋白(GAHIgG-y)购自上海生物制品研究所。重组人钙调素(rhCaM)由本室自行研制[3]，硝酸银(AgNO3)和其它市售化学试剂等均为分析纯。 2．2 胶体金纳米粒子的制备与表征
用柠檬酸钠还原法[4]制备胶体金，具体步骤如下：取1％的氯金酸1mL加入99mL去离子水，加热煮沸，根据制备的纳米粒径大小不同，选择不同的柠檬酸钠(10g／L)加入量，并于搅拌条件下迅速将其?昆匀，待溶液变成橙红色后继续加热5min，即为所需直径的胶体金纳米粒子溶液，待其冷却后滴加于铜网上，空气中干燥后于透射电镜(TEM)下观察，摄片后计数并测量胶体金纳米粒子的平均直径。 2．3 胶体金纳米粒子与蛋白分子标记
选择4种不同的蛋白质分子，分别用于与不同粒径的胶体金纳米粒子结合。首先确定各种蛋白质分子稳定胶体金的用量，并用0．01mol／LK2CO3调节胶体金溶液pH至略高于所标记蛋白质分子的等电点附近[5,6]，于磁力搅拌下逐滴加入所标记蛋白溶液，完毕后继续搅拌5min，加入10g/L PEG-20000，至终浓度为0．5g／L，1500r／min离心20min，以除去过度标记的胶体金蛋白质分子结合物，上清再于12000r／min离心45min，吸弃上清，沉淀用原体积1／10量的10g／L BSA-PB(含0．1g／L NaN3)混悬，即为包敷有蛋白质分子的胶体金结合物(GCP-Protein)，置于4℃冰箱内保存备用。 2．4 琼脂糖凝胶电泳与银染色
将浓度为10．0g／L的琼脂糖(用0．05mol／LpH 8．6巴比妥钠-HCl缓冲液配制)融化后浇板，胶层厚度控制在1．6mm～1．7mm，在凝胶板的一端平行打孔(置电泳槽的阴极端)，孔径3mm，并于孔内分别加入待分离的胶体金样本10μL，于100V条件下电泳2~5h(随凝胶板长度不同可作相应调整)，完毕后将琼脂糖凝胶板于37℃烘干，再用新鲜配置的银显影液(AgNO3-对苯二酚)于室温避光作用15 min[7]，蒸馏水冲洗后晾干，CCD(Mustek F／B scanner，台湾Mustek公司)摄像扫描记录结果。 3．1 胶体金纳米粒子粒径表征及琼脂糖凝胶电泳分离结果
化学还原法制备胶体金可以认为是"结晶"的过程，颗粒大小及均匀与否取决于"晶核"的形成是否同步及"晶核"数目的多少，任何极少量的污染都有可能干扰"结晶"的过程，而导致制备的失败。本文通过改变柠檬酸钠的剂量，制备了3种不同粒径(分别为5nm，15nm和50nm左右)的胶体金纳米粒子。从表1中可以发现粒径愈大，其均一程度愈高，粒径愈小，则其离散度愈大，与文献的结果相一致[4]。
胶体金因其特有的性质表面带有负电荷，在特定电场中可由负极向正极方向泳动，但可因其粒径大小及所带电荷量的不同而在电场中的分布有所差异。本文提供的研究结果表明，小粒径的胶体金较大粒径的纳米粒子在电场中的泳动速度快(见)。图中a为混合组分，包括金胶体-1，金胶体-2和金胶体-3；b为金胶体-3(50nm)；c为金胶体-2(15nm)；d为金胶体-1(5nm)。有趣的是，胶体金在琼脂糖凝胶中的泳动行为类似于蛋白分子的免疫火箭电泳，其在泳道中呈现出弥散状分布的特征。据此我们认为可能有如下几点原因所致：(1)粒径大小分布不均；(2)胶体金纳米粒子所带的电荷量不同；(3)胶体金的重力作用。 3．2 胶体金纳米粒子包敷蛋白质分子后的琼脂糖凝胶电泳分离结果
将3种不同粒径胶体金纳米粒子标记的BSA与SPA，rhCaM和GAHIgG-r包敷的15nm胶体金同时于琼脂糖凝胶中电泳，结果发现胶体金-蛋白分子结合物均可得到很好的分离，3种不同粒径的胶体金-BSA结合物以小粒径(5nm)的泳动速度快，大粒径(50nm)的泳动速度慢。而以相同粒径胶体金(15nm)标记的蛋白质分子在琼脂糖凝胶中的泳动速度依次为BSA，SPA，rhCaM和GAHIgG-r球蛋白(见)，图中a为金胶体-1标记的BSA(5 nm)；b为金胶体-2标记的BSA(15nm)；c为金胶体-3标记的BSA(50nm)；d为金胶体标记的混合组分：包括金胶体-1，金胶体-2和金胶体-3；e为金胶体-2标记的SPA(15nm)；f为金胶体-2标记的rhGaM(15nm)；g为金胶体-2标记的GAHIgG-r(15nm)；h为金胶体-2标记的BSA,SPA，rhCaM和GAHIgG-r混合组分(15nm)。这与蛋白质分子在电场中的泳动顺序相一致(资料未列出)，不同的是该结合物兼有胶体金和蛋白质分子的双重特性，其在电场中的泳动行为既有别于胶体金颗粒，又不同于单纯的蛋白质分子。如CAHIgC-r球蛋白在pH 8．6条件下，静电荷为零，而在电场中不发生泳动[1]，但当其与胶体金结合后即带有负电荷，故此在电场中向阳极泳动。该项结果为我们研究特定生物结构分离和微结构的制作提供了很好的实验依据。 3．3 胶体金纳米粒子及其蛋白标记物在琼脂糖凝胶电泳中的差异分布
分别将3种不同粒径的胶体金纳米粒子标记结合不同的蛋白质分子，并与未结合蛋白分子的胶体金颗粒同时于琼脂糖凝胶中电泳，测定其中心原点至泳动前沿的距离，并与相同粒径的裸金泳动距离相比较，求得其比值(Rv=GC-protein/GC)，结果见表2。表明胶体金颗粒包敷蛋白质分子后，其在电场中的泳动行为不同于裸金的纳米粒子，且随标记的蛋白质分子不同而存在有很大程度的差异。在3种不同粒径的胶体金颗粒中，4种蛋白标记物均以小粒径(5nm)的泳动速度快(速度)，但其相对泳动速度则以大粒径(50nm)的为(只，值)。笔者认为，上述结果的差异除与标记蛋白质分子本身的性质有关外，还与胶体金的粒径大小及其在特定pH条件下所带的电荷量有密切关系。 4 结 论
胶体金-蛋白结合物兼有胶体金和蛋白质分子的双重特性，其在电场中的泳动行为既有别于胶体金颗粒，又不同于单纯的蛋白质分子，且不同粒径胶体金纳米粒子及其包敷蛋白质分子后在琼脂糖凝胶电泳中的差异分布，为我们研究特定生物结构分离、配体分子检测及微器件制作方面提供了一种新的思路。
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