芯片技术

生物芯片技术概论
    生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。它的出现将给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命。 
生物芯片技术研究的背景 
    原定于2005年竣工的人类30亿碱基序列的测定工作（Human Genome Project，基因组计划）由于高效测序仪的引入和商业机构的介入有望在2000年底提前完成，届时人类遗传信息将一览无遗。怎样利用该计划所揭示的大量遗传信息去探明人类众多疾病的起因和发病机理，并为其诊断、治疗及易感性研究提供有力的工具，则是继人类基因组计划完成后生命科学领域内又一重大课题。现在，以功能研究为的后基因组计划已经悄然走来，为此，研究人员必需设计和利用更为高效的硬软件技术来对如此庞大的基因组及蛋白质组信息进行加工和研究。建立新型、高效、快速的检测和分析技术就势在必行了。这些高效的分析与测定技术已有多种，如DNA质谱分析法，荧光单分子分析法，杂交分析等。其中以生物芯片技术为基础的许多新型分析技术发展快也发展潜力。早在1988年，Bains等人就将短的DNA片段固定到支持物上，以反向杂交的方式进行序列测定。当今，随着生命科学与众多相关学科（如计算机科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等）的迅猛发展，为生物芯片的实现提供了实践上的可能性。生物芯片的设想早起始于80年代中期，90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，即将特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上，作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出优点。 

光引导原位合成 
    原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物，可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成的Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前，预先将玻片氨基化，并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板使需要聚合的部位透光，不需要发生聚合的位点蔽光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光部分的氨基解保护，从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护，所以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类，就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于照相平板印刷技术每步的合成效率较低（95%），合成30nt的终产率仅为20%，所以该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸。在此基础上，有人将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，将每步合成产率提高到99%，但制造工艺复杂程度增加了许多。所以如何简便地提高合成产率是光引导原位合成技 术有待解决的问题。(参见图1.) 
微点阵芯片的制作方法 
    仅就目前的发展情况，微点阵芯片主要包括DNA微点阵芯片（又称基因芯片?或DNA芯片）和蛋白或多肽微点阵芯片两种。不过相信，基于其它生物大分子特异性相互作用的生物芯片也会相继问世。所谓DNA微点阵芯片是指同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特异性对DNA样品的序列信息进行高效率的解读和分析，以用于基因表达谱的检测、突变筛查、DNA多肽性分析、DNA测序和基因组文库作图等研究。类似地，多肽或蛋白微点阵芯片则将许多序列不同的多肽或蛋白分子按照预定的位置固定于芯片片基上，通过蛋白或多肽与其特异结合分子的相互作用而实现对样品蛋白或其它配体作用特异性的研究，包括抗原表位分析、蛋白定量检查等。 
点样法 　　
    点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上，并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理，例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。

分子印章原位合成 
    分子印章技术与上述两种方法在合成原理上相同，区别仅在于该技术利用预先制作的印章将特定的合成试剂以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。后续反应步骤类似与压电打印原位合成技术。分子印章类似于传统的印章，其表面依照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定位点进而进行合成反应。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章即可在支持物上原位合成出位置和序列预定的寡核苷酸或寡肽阵列。从这一点上讲，分子印章原位合成技术与压电打印原位合成技术更为相似。分子印章除了可用于原位合成外还可以点样方式制作微点阵芯片。例如已有人将分子印章技术用于蛋白微点阵芯片的制作。 以上三种原位合成技术所依据的固相合成原理相似，只是在合成前体试剂定位方面采取了不同的解决办法，并由此导致了许多细节上的差异。但，三种方法合成时都必需解决的问题是必需确保不同聚合反应之间的定位，这一点对合成高密度寡核苷酸或多肽阵列尤为重要。同时，由于原位合成每步合成产率的局限较长(>50nt)的寡核苷酸或寡肽序列很难用这种方法合成。但是，由于原位合成的短核酸探针阵列具有密度高、杂交速度快、效率高等优点，而且杂交效率受错配碱基的影响很明显，所以原位合成的DNA微点阵适合于进行突变检测、多态性分析、表达谱检测、杂交测序等需要大量探针和高的杂交严谨性的实验。 
打印原位合成 
    压电打印原位合成的方式类似于喷墨打印机，合成原理与传统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为：合成前以与光引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理，使其带有反应活性基团，例如伯氨基。同时，将合成用前体分子（DNA合成碱基、cDNA和其它分子）放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护，所以每步延伸的合成产率可以高达99%，合成的探针长度可以达到40~50nt。以后每轮偶联反应依据同样的方式将需要连接的分子喷印到预定位点进行后续的偶联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成出大量的寡核苷酸探针。
芯片的应用
    与PCR技术一样，芯片技术已经开展和将要开展的应用领域非常的广泛。生物芯片的个应用领域是检测基因表达。但是将生物分子有序地放在芯片上检测生化标本的策略是具有广泛的应用领域，除了基因表达分析外，杂交为基础的分析已用于基因突变的检测、多态性分析、基因作图、进化研究和其它方面的应用，微阵列分析还可用于检测蛋白质与核酸、小分子物质及与其它蛋白质的结合，但这些领域的应用仍待发展。对基因组DNA进行杂交分析可以检测DNA编码区和非编码区单个碱基改变、确失和插入，DNA杂交分析还可用于对DNA进行定量，这对检测基因拷贝数和染色体的倍性是很重要的。
    用于DNA分析的样品可从总基因组DNA或克隆片段中获得，通过酶的催化掺入带荧光的核苷酸，也可通过与荧光标记的引物配对进行PCR扩增获得荧光标记DNA样品，从DNA转录的RNA可用于检测克隆的DNA片段，RNA探针常从克隆的DNA中获得，利用RNA聚合酶掺入带荧光的核苷酸。
    对RNA进行杂交分析可以检测样品中的基因是否表达，表达水平如何。在基因表达检测应用中，荧光标记的探针常常是通过反转录酶催化cDNA合成RNA，在这一过程中掺入荧光标记的核苷酸。用于检测基因表达的RNA探针还可通过RNA聚合酶线性扩增克隆的cDNA获得。在cDNA芯片的杂交实验中，杂交温度足以除DNA中的二级结构，完整的单链分子（300-3000nt）的混合物可以提供很强的杂交信号。对寡核苷酸芯片，杂交温度通常较低，强烈的杂交通常需要探针混合物中的分子降为较短的片段（50-100nt），用化学和酶学的方法可以改变核苷酸的大小。
    不同于DNA和RNA分析，利用生物芯片进行蛋白质功能的研究仍有许多困难需要克服，其中一个难点就是由于许多蛋白质间的相互作用是发生在折叠的具有三维结构的多肽表面，不像核酸杂交反应只发生在线性序列间。芯片分析中对折叠蛋白质的需要仍难达到，有以下几个原因：，芯片制备中所用的方法必需仍能保持蛋白质灵敏的折叠性质，而芯片制备中所有的化学试剂、热处理、干燥等均将影响到芯片上蛋白质的性质；第二，折叠蛋白质间的相互作用对序列的依赖性更理强，序列依赖性使得反应动力学和分析定量复杂化；第三，高质量的荧光标记蛋白质探针的制备仍待进一步研究。这些原因加上其它的问题减慢了蛋白质芯片检测技术的研究。
基因芯片应用
寻找新基因
DNA测序
疾病诊断
药物筛选
毒理基因组学
农作物优育和优选
环境检测和防治
食品卫生监督
司法鉴定


二、应用领域
    1 基因表达水平的检测
    用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。
    2 基因诊断
    从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中有商业化价值的应用。
    3 药物筛选
    如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再c DNA表达文库得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有，利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。
    4 个体化医疗
    临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性，SNP），导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如，现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。
    5 测序
    基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性。据未经证实的报道，去年有一种不成熟的生物芯片在15分钟内完成了1．6万个碱基对的测定，96个这样的生物芯片的平行工作，就相当于每天1．47亿个碱基对的分析能力！
    6 生物信息学研究
    人类基因组计划（HGP）是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。基因的功能并不独立的,一个基因表达的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变，从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立的理解某个基因的功能已经远远不够了，需要我们站在更高的层次全面的理解这种相互关系，全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息，并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的，使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能，必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台，成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作，但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式，几周内 获得的信息用其它方法需要几年才能得到。
    由于人类基因只是地球上几十万种生物基因资源中的一份子,在今后的几十年内,人类将测出所有物种的"基因图谱"。因此,类似如人类基因组计划的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变，从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立的理解某个基因的功能已经远远不够了，需要我们站在更高的层次全面的理解这种相互关系，全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息，并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的，使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能，必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台，成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作，但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式，几周内获得的信息用其它方法需要几年才能得到。
    由于人类基因只是地球上几十万种生物基因资源中的一份子,在今后的几十年内,人类将测出所有物种的"基因图谱"。因此,类似如人类基因组计划的基因研究和生物信息产业,还仅仅是一个起步，其将来的发展前景是无法估量的。生物芯片作为生物信息学的主要技术支撑和操作平台，其广阔的发展空间就不言而喻。
    在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台，这从我国99年3月国家科学技术部刚起草的《医药生物技术“十五”及2015年规划》中便可见一斑：规划所列十五个关键技术项目中，就有八个项目（基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术）要使用生物芯片。生物芯片技术被单列作为一个专门项目进行规划。总之，生物芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具有重大的应用前景。
三、基因芯片的前景
    基因芯片技术具有高度并行性、多样性、微型化和自动化这四大特点。高度并行性有利于基因芯片所示图谱的快速对照和阅读，效率大为提高；多样性则提供了样品的多指标测定；微型化的好处在于对样品的需要量非常少，而且还能节省试剂用量，降低成本；自动化使得人力投入减少并保证了质量。同时，它还具有操作简便、信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势
    有关认为，生物芯片将在以下四个方面具有广阔的前景：
    药物筛选和新药开发由于所有药物(或兽药)都是直接或间接地通过修饰、改变人类(或相关动物)基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况(蛋白质芯片)的能力，利用芯片进行大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物实验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。
    中药基因组学研究和我国的中药现代化中药基因组学的含义是通过现代科学技术手段结合传统中药理论和现代科学理论，将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达调控的影响关联起来，在分子水平上用现代基因组学，特别是功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中药理论及作用机理。能够做到这一点，将极大地推动我国几千年悠久深厚的中药文化资源得到进一步的挖掘。 
    疾病诊断基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
    环境保护及其他在环境保护上，基因芯片也有广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，另一方面还可用于农业、商检、司法等领域。
预测，基因芯片及相关产业将取代微电子芯片产业，成为本世纪的产业。