DNA芯片

发展历史

　　芯片的概念及发展历史 D NA 芯片 （又称基因芯片、生物芯片） 技术是自 20 世纪 90 年代初发展起来的新兴 技术， 是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针， 有规律地排列固定于支持物上， 然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交， 再通过激光共聚焦荧光检测系统或 CCD 成像扫描系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比 较和检测，从而迅速得出所要的信息。顺应上述发展要求的产物，它的出现为解决此类问题 提供了光辉的前景。该技术系利用芯片制造技术，将大量 （通常每平方厘米点阵密度高于 400） 探针分子固定于支持物上，再与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的 杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 它可以对生命科学与医学中的各种生物 化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试 和分析。它的出现将给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品 与环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命。

　　20 世纪 80 年代，Ba i ns 等人就曾将短的 D NA 片断固定到支持物上，借助杂交方式 进行序列测定。 DNA 芯片从实验室走向产业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和 但 照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入， 它使得合成、 固定高密度的 数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术可以对杂交信号进行实 时、 灵敏、 准确的检测和分析。 1996 年， f yme t r i x 公司成功研制出首批实用 DNA 芯 Af 片和芯片阅读器，为 DNA 芯片产业开创了先河。DN A 芯片技术由于同时将大量探针固定 干支持物上， 所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析， 从而解决了传统核酸印迹杂 交 （ Sou t he rnb l o t t i ng 和 No r t he r n b l o t t ing 等） 技术操作复杂、自动化程度低、 操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方 法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因 组文库作图及杂交测序等。

类型与特点

　　根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类：

　　原位合成芯片（synthetic gene chip）

　　采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。这种芯片的集成度教高，可达10万～40万点阵/平方厘米。但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为8～20个核苷酸残基（nucleotide，nt），最长为50nt，因此需要使用多个相互重叠的探针片进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。

　　DNA微集芯片（DNA microchips）

　　将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集芯片，又称为DNA微集陈列（DNA microarray）。这类芯片集成度相对较低，可达1万～10万点阵/平方厘米，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用来自基因组的较长的DNA片段；可以是双链，也可以采用单链的DNA或RNA片段，且技术实现未受到严格的专利控制，因而近年来发展很快。探针的长度可达100～500nt。

制备

　　一、芯片的制备

　　芯片制备的基本原理。

　　芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集陈列的制备三个方面。

　　1.支持物的预处理

　　目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和膜性材料。实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前，这些基因可与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来，合成时在光照下除去光敏保护基团，该活性基团又可以和活化的单核苷酸发生化学反应。另一方面，这些活性基团可与DNA分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷吸附带负电荷的DNA探针。

　　2.原位合成芯片的制备

　　原位合成芯片是采用显微光蚀刻（photolithography）技术或压电打印（piezoelectric printing）技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成。显微光蚀刻技术也称为光引导聚合技术（light-directed synthesis），它不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸，多肽固相合成技术相结合的产物，是原位合成芯片的主要方法。压电打印法的装置与普通的彩色喷墨打印机相似，所用的技术也是常规的固相合成方法。

　　3.DNA微集陈列的制备

　　DNA微集陈列的制备采用的是预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上的方式。

　　二、样品的准备

　　样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。

　　1．样品的分离纯化

　　主要从活组织或血液中获得DNA或mRNA，这个过程包括细胞分离，破裂，去蛋白，提取及纯化核酸的过程。

　　2．样品的扩增

　　测定时往往需要较多的样品分子，因此对于分离获得的基因组DNA通过PCR技术直接扩增，对于mRNA则需要逆转录，制备cDNA。

　　3.样品的标记

　　标记物主要有荧光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。带有标记的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通过DNA或cDNA扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。

　　样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，反转录以及标记等各环节要求严格操作。荧光标记分辨率高于同位素标记，而且可以采用双色，如对照样品标红色，待检样品标绿色，有助于结果分析与判断。

　　三、分子杂交

　　芯片杂交是应用标记的待测样品（靶序列）与固定在载体表面的探针进行的复杂过程。

　　依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是：42℃，50%甲酰胺，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt试剂。也可采用65℃，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt试剂或者65℃，10%SDS，7%PEG-800。

　　杂交过程类似Northern或Southern杂交，如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。

　　四、检测分析

　　芯片杂交信号的检测可应用荧光检测法、质谱法、化学发光法、光导纤维法以及生物传感器法。其中激光共聚焦荧光检测法是最常应用的方法：激光从芯片的背面切入，聚焦于芯片与靶溶液的相互作用面，与探针杂交的靶序列标记物被激发产生荧光，经过棱镜聚焦而被检测器检测。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号，不完全杂交显示较弱的信号。

工作原理

　　核酸是由核苷酸(nucleotide) 按一定次序连接而成的生物有机高分子。碱基可以分为 5 种碱基，分别为腺嘌呤(adenine ，缩写为 A) 、胸腺嘧啶 (thymine ，缩写为 T) 、尿嘧啶 (uracil ，缩写为 U) 、胞嘧啶 (cytosine ，缩写为 C) 和鸟嘌呤(guanine ，缩写为 G) 。两 条核苷酸分子链能够通过连续的碱基互补相结合， 而互补方式只能是 A 对 T、 A 对 U 或 C 对 G。最常提到的核酸分子是 DNA( 由 A、 T、 C 、 G 序列构成)和 RNA( 由 A 、 U、 C、 G 序列构成) ，其中 DNA 分子就是通过这种碱基互补方式形成其稳定的双链螺 旋结构。 DNA 分子链上的一些片段能够以碱基互补的方式将其信息传递给 mRNA 分子 (称为转录) ，然后通过 mRNA 合成出蛋白质(称为翻译) ，这些片段被称为基因。如果两 个核酸分子的碱基序列不互补，那么它们之间的配对结合(又称为杂交)就不会发生。利用这 种高度的特异性，含有一个已知基因序列的核酸分子，可被视为一个分子探针 ， 该探针通 过和生物样品中与之互补的目标核酸分子的杂交来检测出相应的基因。

　　核酸芯片，又称 DNA 芯片或基因芯片，就是把成千上万个不同序列的核酸探针分子 以点阵的形式固定在芯片表面， 然后和经过荧光标记的样品进行杂交反应。 在杂交后的清洗 步骤中，没有和探针结合上的核酸分子将被去除，而结合到探针上的目标核酸分子，其荧光 标记在特定波长激光激发下会发出荧光信号， 其信号强度表征了样品中被检测到的目标核酸 分子或基因的总量或浓度。 借助专门的荧光扫描设备得到的这样一张各探针点亮度不相同的 杂交图谱，经过计算机软件的处理，研究者可以一次获得样品中众多基因的量化分析结果， 从而迅速地指导与基因有关的一系列研究。

应用

　　DNA芯片使用的基本流程。

　　DNA芯片使用包括待测样品准备、分子杂交和检测分析3个步骤。

　　1.待测样品的准备

　　样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记。

　　首先采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片检测仪器的灵敏度有限，要求对样品中靶序列进行高效而特异地扩增。样品的标记主要采用荧光法，也可以用生物素，放射性核素标记法。

　　2.分子杂交

　　待测样品经扩增和标记处理后，即可与DNA芯片上的探针陈列进行分子杂交。芯片杂交与传统的Southern印迹等杂交方法类似，属固-液杂交。探针分子固定于芯片表面，与位于液相的靶分子进行反应。芯片杂交的特点是探针的量显着大于靶基因片段，杂交动力学呈线形关系。杂交信号的强弱与样品中靶基因的量成正相关。

　　3.检测分析

　　芯片杂交及清洗后，未杂交分子被清除，带有荧光标记的靶DNA（杂交分子）与其互补的DNA探针形成杂交体，在激光的激发下，荧光素发射荧光。以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来。

　　DNA芯片技术在医学领域的应用

　　DNA芯片用于基因诊断、DNA序列测定、临床药物筛选、法医鉴定、 食品工业和环境监测等方面。在医学领域具有极大的潜力。

　　1.基因诊断

　　应用DNA芯片技术可以在DNA水平检测与疾病相关的内源性或外源性基因；应用表达芯片可以在mRNA水平分析同一组织在不同的发育阶段，正常及病理状态基因表达的差异，也可以分析不同组织同一基因在正常及病理状态下表达的差异，从而为疾病诊断与分类，病原微生物分型提供科学依据。

　　2.DNA序列测定

　　任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解成一系列碱基数固定、错落而且重叠的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五个错开1个碱基但是可重叠7个碱基的8体亚序列，当然也可以分解成7体，9体或其他整数（n体）亚序列。如果用某种方法将5个亚序列全部测定出来，就可以重新组建原来的核苷酸排列顺序。应用这一原理，可以合成或应用已知序列的所有可能的n体寡核苷酸，并将其固定在芯片表面，然后与标记的待测靶序列杂交，经过重新组合，即可得到待测的DNA序列。

　　3.临床药物筛选

　　临床许多细菌对药物具有抗药性，但是不同的亚型对同一药物的敏感性不同。DNA芯片技术已被用于鉴定结核菌及非典型分支杆菌的基因型与耐利福平的相关性以及HIV产生抗药性与其逆转录酶及蛋白酶基因突变的相关性。这为临床选择敏感药物提供了有效手段。

　　4.其他领域

　　法医鉴定、食品工业、环境监测等方面，DNA芯片技术也将具有极大的潜力。