一种深海微生物量自动检测仪检测系统的实现

 

　　深海微生物量的检测是深海生物圈研究的重要内容，对深海生态学研究具有重要意义。活细胞中ATP与有机碳的比率较稳定，通过测定样品中ATP的浓度就可以推算出微生物浓度[1].ATP生物发光法检测微生物量浓度具有方法简单、检测周期短、灵敏度高、线性度高的特点。

　　ATP（adenosine-triphosphate）中文名称为腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷（腺苷三磷酸），简称为ATP,其中A表示腺苷，T表示其数量为三个，P表示磷酸基团，即一个腺苷上连接三个磷酸基团。其结构简式是：A-P~P~P,其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量，因此称为高能磷酸键，用"~"表示。在细胞的生命活动中，ATP远离A的一个高能磷酸键易断裂，释放出一个磷酸和能量后成为腺苷二磷酸（ADP）。在有机物氧化分解或光合作用过程中，ADP可获取能量，与磷酸结合形成ATP.ATP和ADP这种相互转化，是时刻不停的发生且处于动态平衡之中的。

　　海水中ATP的浓度介于10-11~10-7 mol/L数量级之间，ATP生物发光反应光信号较微弱，具有短暂性、稳定性差、发光曲线呈类抛物线型、信号易被淹没的特点。因此，仪器必须满足以下要求：（1）噪声电压在0.01 mV左右；（2）ATP浓度大于10-9 mol/L时，测量误差小于1%;（3）ATP浓度分辨率为10-11 mol/L,即转换电压分辨率可达0.1 mV.

　　图1是仪器检测系统组成框图。根据上面的要求，相对于常规的检测系统，本仪器要具有超低噪声和高的特点。因此仪器要在对其噪声进行分析的基础上，选取低噪声器件，并采用软件标准线标定的方法降低噪声，提高。

 

 

　　1 仪器检测原理

　　ATP荧光检测法是利用ATP-虫荧光素酶发光体系。在ATP-虫荧光素酶生物发光体系中，当ATP浓度介于10-15 mol/L~10-6 mol/L范围内，荧光素-荧光素酶过量时，发光强度与ATP的浓度成正比[2],[3].反应中发光强度信号是随时间变化的抛物线，在反应到5 s左右时，发光强度，然后逐渐减低。仪器在ATP生物发光反应开始5 s后进行检测。

　　2 仪器检测系统设计

　　检测系统硬件主要由五部分组成（如图1），即光电倍增管（PMT）、信号转换模块、电源管理模块、通信模块及微处理器。

　　（1）光电倍增管

　　将微弱光信号转换成电信号的真空电子器件。光电倍增管用在光学测量仪器和光谱分析仪器中。它能在低能级光度学和光谱学方面测量波长200~1200纳米的极微弱辐射功率。闪烁计数器的出现，扩大了光电倍增管的应用范围。激光检测仪器的发展与采用光电倍增管作为有效接收器密切有关。电视电影的发射和图象传送也离不开光电倍增管。光电倍增管广泛地应用在冶金、电子、机械、化工、地质、医疗、核工业、天文和宇宙空间研究等领域。

    整个模块包含一个感光直径为13 mm的光电倍增管以及一个Walton高压电源。模块中还包括一个高、低噪声的放大器。模块的光谱响应范围185 nm~900 nm,响应波长在600 nm（6.0×1010 V/lm），输出线性度±0.5%,暗电流在nA级，内部放大器放大倍数为0.1 V/μA.采用该光电倍增管模块可以满足降低噪声、提高的要求。

　　（2）信号采集转换模块

　　系统采用CIRRUS LOGIC公司的CS5532作为信号放大转换设备，信号采集转换模块原理图如图2.

 

 

　　CS5532是高集成度的ΔΣ模数转换器，由于运用了电荷平衡技术，其性能可以达到24 bit.该AD转换器适合过程控制、生化和医疗等应用领域的单、双极性小信号。CS5532内部有一个超低噪声的斩波稳定增益可编程放大器，噪声为

，线性误差0.0007% FS,无噪声分辨率可达23 bit,校准电压可选输入范围-5 mV~5 V,可选字速率7.5 Hz~3 840  Hz.

　　系统采用15 Hz的字速率、16倍增益，CS5532的典型RMS（有效位）噪声误差27 nV,无噪声分辨率为22 bit.

　　（3）其他模块

　　系统选用的微处理器是TI公司的MSP430F1611.MSP430通过MAX3222芯片把异步串口通信总线的逻辑电平转换为RS232信号电平与上位机（PC）通信，原理图如图3.

　　3 噪声分析

　　检测系统的噪声主要由光电倍增管、信号前置放大电路及模数转换器（ADC）三部分产生。

　　光电倍增管及信号前置放大电路的等效电路图如图4.

　　其中光电倍增管等效噪声电压Ea由（2）式得到[4~7]:

 

 

　　在没有荧光信号时进行了检测，结果如图5。

　　图5反映了上述干扰噪声信号以及PMT自身基底的综合情况。由图5可以看到，本系统的噪声电压在0.098 mV左右，设计对干扰和噪声的屏蔽能力较强。

　　4 软件优化设计及结果

　　要满足对深海ATP浓度的检测，系统必须具有高，对信号的微弱变化具有高灵敏度。系统采用了软件标准曲线法来提高检测。

　　系统采用标定法来对测得的电压值与ATP浓度进行换算。对一系列一定浓度的标准溶液进行检测，测得其转换电压值。标准液浓度分别是10-7、10-8、10-9、10-10、10-11 mol/L,每次测量连续采集30组数据后取平均值。这些平均值对应着ATP荧光反应光信号转换的电压信号，将转换电压取对数得到数值称为相对转换值，该值作为纵轴，ATP浓度作为横轴，得到曲线如图6.由曲线可见，在一定范围内ATP浓度与转换电压之间有较好的线性关系，将该曲线作为标准曲线。图6为得到的标准曲线，转换电压值V与ATP浓度C分别取对数后的线性回归方程为lgV=2E+10lgC+0.6815,其相对关系系数为0.9963,具有较好的相关性。在软件中用标准曲线对测得的电压数据进行标定，从而提高ATP的浓度检测。

　　基于上述方法，在光电倍增管模块的光电增益为4×1014 V/lm时，用系统对5种已知浓度的溶液进行ATP浓度测量，测得结果如表1.

 

　　由表1数据可知，本系统误差较小，平均约为0.13%,满足了对ATP生物发光反应的弱电信号的检测。

　　本检测系统检测方法简单、检测周期短、灵敏度高、噪声低、满足深海微生物量原位检测仪的要求。