基因芯片技术

二、探针阵列（array）的形成方式：

　　 已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上，这些方法可分为原位合成(in situ synthesis)与预先合成然后点样(off-chip DNA synthesis)两种。原位合成（in situ synthesis）主要是指光引导聚合（Light-directed synthesis）技术（表2），当然该技术除了可以用于合成寡聚核苷酸外还可以用于寡肽的合成。光引导聚合技术是照相平板印刷技术(photolithography)与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透结果。照相平板印刷技术中可用光引导形成电子线路（electrical circuits），利用类似的道理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。其原理如图1。

表2 光引导聚合技术简要说明

图1 光引导聚合技术原理图

　　合成前，先使玻璃支持物氨基化，然后用光不稳定保护基（photo labile protecting group）将NH₂基保护起来。每次选择适当的挡光板（mask）使需要聚合的部位透光，不需发生聚反应的部分不透光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光的部分NH₂解保护。合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基团。类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。每次通过控制挡光板（透光与不透光）的图案以及参与反应的单体种类，就可以实现在特定位点同时合成大量已知序列寡聚体的目的。该方法以传统的亚磷酰胺合成法为基础，只需较少步骤就可以合成大量不同序列分子高密度的微小点阵(microarray)。例如，合成65,536个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需32步反应，8小时就可完成。 　然而，该技术难度较大，除了在基因芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司使用此技术原位合成多聚体外，其他公司和研究单位多数使用第二种方法(注：美国第5,744,305号说明固相表面点阵密度超过400spots/cm² 将侵犯Affymetrix 公司产权)。这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA或蛋白固相合成仪进行。多聚物合成后再用特殊的点样装置或仪器（如美国Cartesian Technologies公司的PixSys NQ/PA系列产品）将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过特殊处理的玻璃片上，点阵密度可达到2500spots/cm²（Yershov et al报道点阵密度可达20,000-30,000spots/cm²）。尽管如此，两种方法在样品的处理、标记和检测分析等方面具有许多相似之处，举例说明如图2。
　 　另外，将大量的随机肽段（序列随机而其每一已知序列肽段在玻片上的位置是预先决定好的）固定到玻片上就可以用它去和具有特异亲和力的生物大分子进行作用，借此筛选出具有特异亲和作用的寡肽序列。这与噬菌体展示（Phage display）技术具有类似之处，但光引导聚合技术可作为一种对噬菌体展示技术的有机补充，使寡肽序列中能够引入非天然的氨基酸（如D型氨基酸）及其衍生物等，从而有可能增加肽分子抵抗蛋白酶水解的能力、改善侧链结构提高亲和力等，而这些是噬菌体表面展示技术所无法实现的。

表3 不同去保护方式对聚合效果的影响

　　在些基础上，有人(Glenn McGall)将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相合，以酸作为保护剂，使探针密度达到16,000spots/cm²以上（有望接近10⁶spots/cm²）。我们知道，光波作为电磁波的一种具有波粒二象性，所以具有衍射的特性（图3）。当挡光板透光孔间的距离足够小的时候，由于光的衍射，使受光部分与非受光部分光照对比度下降，如果仍用前述光引导合成技术就会使去保护作用不够理想，受照射部分与其它部分差别不够大，聚合纯度不高，降低了检测结果的信噪比(signal-noise ratio)，从而影响了聚合点阵的密度的提高。光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，所以当照度达到一定值时它就会解离，这样就部分地解决了由于光衍射引起的问题(图4)。虽然由此增加了技术的复杂性，但却明显地提高了聚合点阵的密度。
　　但也有人(T. H. Newman et al J. Vac. Sci. Technol. B5,88(1987))利用波长更短的物质波如电子射线作为去保护基剂使聚合密度高达到10¹⁰spots/cm²。

三、检测原理及方式：

　　对于以核酸杂交为原理的检测技术，主要过程为：首先用生物素标记经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交（图2）。用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin作为显色物质，图象的分析则用落谢荧光显微镜(epifluorescence microscope)、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描，由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。

四、利用基因芯片进行杂交测序的原理：

　
　　 基因芯片不仅可对大量基因或序列同时、快速进行定性、定量分析，而且作为一种极有发展前途的测序策略也倍受人们的重视。但从目前的进展情况来看，该技术距离大面积的推广应用尚有一段距离。以图5为例，首先将八聚体寡核苷酸所有可能的序列组合合成或固定于片基上，对于每一序列其在片基上的位置是预先决定好的（predetermined）。样品扩增并经标记后与片基上所有序列进行杂交反应。这样，就会出现特定的杂交图谱，有杂交信号部位的寡核苷酸片段与待测样品序列是互补的。（前已述及，具有错配的杂交信号要比正常配对的杂交信号弱许多，借此可将二者区分开。）分析产生杂交信号的寡核苷酸序列的重叠情况进而推导出样品的核酸序列。但由此也可以看到，杂交测序对于具有序列重复的样品是比较难以测定的。

五、基因芯片技术与生物传感器(biosensor) 的结合应用：

六、基因芯片技术的主要应用举例：

　　基因芯片技术虽然仅有几年的发展历史，但其已在分子生物学、生物信息学(Bioinformatics) 等诸多方面产生了重大的影响，下表仅就其主要应用举例说明。

表4  基因芯片技术的主要应用举例